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反向遺傳學(xué)主要是通過DNA重組等技術(shù)有目的地、精確定位地改造基因的精細(xì)結(jié)構(gòu)以確定這些變化對生物體表型性狀的直接影響。為了研究植物的某一個(gè)（類）基因的功能，研究者通常需要獲得該基因的功能缺失突變體或者通過RNAi技術(shù)抑制該目的基因的表達(dá)。由于目前公用突變體庫只有少量模式植物的突變體，因此通過RNAi技術(shù)來抑制目的基因的表達(dá)水平而探討該基因的生物學(xué)功能，是反向遺傳學(xué)研究常用的關(guān)鍵手段之一。盡管如此，通常利用double-strand RNAs（RNAi）技術(shù)產(chǎn)生Small RNA而干擾靶基因表達(dá)，常常會導(dǎo)致脫靶效應(yīng)（off-target）——也就是非特異性地抑制了非目的基因的表達(dá)，這最終會干擾研究者分析目的基因的生物學(xué)功能。

miRNA是一類可以在轉(zhuǎn)錄或（和）翻譯水平上特異地抑制相應(yīng)靶基因表達(dá)水平的small RNA。miRNA的功能特點(diǎn)正好可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)RNAi的不足。近年來，研究人員利用天然miRNA的生成和作用原理，開發(fā)了人工miRNA用來抑制一個(gè)或多個(gè)目的基因的表達(dá)。

目前，構(gòu)建一個(gè)人工miRNA前體主要通過over-lapping PCR技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，這通常需要四個(gè)PCR反應(yīng)才能產(chǎn)生最終的人工miRNA前體結(jié)構(gòu)。這種技術(shù)有三個(gè)缺點(diǎn)：（a）過多的PCR反應(yīng)步驟增加了堿基突變的可能性；（b）過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力；（c）不適合批量操作。為了改進(jìn)該技術(shù)，植物分子生物學(xué)組研究人員梁崗博士和余迪求研究員等人成功構(gòu)建了兩套人工miRNA載體（pAMIR395a和pAMIR319a)，這兩個(gè)載體包含了天然miRNA前體的5'和3'區(qū)域。研究人員可以通過一個(gè)PCR反應(yīng)以產(chǎn)生相應(yīng)的人工miRNA發(fā)夾區(qū)，然后通過酶切連接的方式克隆到相應(yīng)的人工miRNA載體，從而產(chǎn)生所需的人工miRNA前體。實(shí)驗(yàn)表明，通過該方法構(gòu)建的人工miRNA前體可以產(chǎn)生成熟的人工miRNA并且能有效地抑制相應(yīng)靶基因的表達(dá)。另外，該研究還證明兩個(gè)人工miRNA前體可以串聯(lián)起來作為同一個(gè)順反子表達(dá)，該順反子產(chǎn)生的兩種人工miRNA可以同時(shí)并有效地抑制其靶基因的表達(dá)，這為研究者同時(shí)抑制多個(gè)基因的表達(dá)提供了技術(shù)支持（見圖一）。這種技術(shù)改進(jìn)可以使研究人員在較短的時(shí)間內(nèi)批量構(gòu)建人工miRNA前體。該研究內(nèi)容日前以《A new strategy for construction of artificial miRNA vectors in Arabidopsis》為題在國際知名學(xué)術(shù)刊物planta上發(fā)表（Planta，2012， 235:1421–1429；DOI 10.1007/s00425-012-1610-5）。

一種構(gòu)建人工miRNA載體的新策略